К СБОРНИКУ МАТЕРИАЛОВ
Климова Е.М., Божков А.И.
*, Вотякова И.А., Дроздова Л.А., Ефимова Н.В.
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ОЦЕНКА И ИНДИВИДУАЛЬНАЯ КОРРЕКЦИЯ
ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
ПРИ РАЗЛИЧНЫХ КЛИНИЧЕСКИХ ФЕНОТИПАХ МИАСТЕНИИ
Институт общей и неотложной хирургии АМН Украины
*НИИ биологии Харьковского национального университета, Харьков
Миастения - это заболевание, проявляющееся прогрессирующей мышечной слабостью, при котором поражаются нервно-мышечные синапсы, вилочковая железа (ВЖ), мышечные клетки. Миастению относят к мультифакториальным заболеваниям, этиология и патогенез, которого до конца не выяснены. Диагноз "миастения" в клинической практике, как правило, ставится с большим опозданием, что связано с трудностями дифференциальной диагностики. Клиническая гетерогенность заболевания велика, наблюдаются существенные различия в патогенезе. Имеется полиморфизм по степени тяжести, выраженности, прогрессированию и локализации нейротрансмиттерных нарушений, характеру поражения ВЖ и адекватности ответа на проводимое лечение. Поражение ВЖ проявляется либо гиперплазией с образованием лимфоидных фолликулов, либо неоплазией, чаще всего в виде лимфоэпителиальных тимом. При миастении поэтапно нарушаются все звенья иммуногенеза и нейроэндокринные реакции, поражаются органы чувств и мышечная система, изменяется ультраструктура и функции желез внутренней секреции. Доказана роль полиморфизма определенных генов в этиопатогенезе данного заболевания. Анализ родословных больных миастенией свидетельствует о доминантном наследовании с вариабельной экспрессивностью. Результаты обследования близнецов показали дисконкордантность по данному заболеванию, что говорило не только о генетической предрасположенности, а о значении средовых триггерных факторов в развитии миастении. Выявлено наличие положительной и отрицательной ассоциации миастении с некоторыми антигенами главного комплекса гистосовместимости HLA I класса и с полиморфизмом генов антагонистов ацетилхолиновых рецепторов (АХР). В семьях больных миастенией и у самих пациентов выявляют высокую частоту заболеваемости различными аутоиммунными расстройствами, такими как рассеянный склероз, системная красная волчанка, ревматоидный артрит. Миастению относят к ряду аутоиммунных заболеваний, при котором происходит нарушение иммунологического контроля, часто (у 60% больных), проявляющееся повышением титра специфических аутоантител к АХР, миоцитам и лимфоцитам ВЖ. Важным является выяснение механизма аутоиммунных реакций при миастении, поскольку от этого зависят варианты лечения, которые могут быть принципиально различными. Известно несколько механизмов формирования аутоиммунных реакций, к которым относится негативная активация В-лимфоцитов в ответ на антигенную стимуляцию, генетический дефект Т-супрессорной субпопуляции, вызывающий отсутствие толерантности в гуморальном звене, образование запретных аутоагрессивных клонов цитотоксических Т-лимфоцитов и блокирование аутоантителами специфических рецепторов. На сегодняшний день не выявлены доминирующие индукторы, вызывающие аутоиммунные заболевания, к которым относится миастения, не определены типы иммунопатологических реакций при различных клинических фенотипах заболевания, не достаточно изучены механизмы рецепторной инициации субпопуляций лимфоцитов и антигенпрезентирующих клеток, не разработаны тест-системы для скрининга разных аутоиммунных реакций.
Целью настоящей работы было выяснение отличий этиопатогенеза различных клинических фенотипов миастении и выявление типов иммунопатологических состояний с помощью разработанной клеточной тест-системы. Исследовали возможные триггерные факторы заболевания: частоту вирусной персистенции, образование антител к ДНК и органоспецифических антител, изменение субпопуляций Тх и Тс, наличие взаимосвязи с различными гаплотипами HLA II класса. Разработаны качественные и количественные критерии скрининга при тестировании иммунопатологических вариантов в случае различных клинических фенотипах миастении.
Для анализа полученных данных всех обследованных больных (253 человека) распределили на две группы: 1 группа (180 человек) - пациенты с гиперплазией ВЖ , 2 группа (73 человека) - пациенты с тимомой, диагностированной после тимэктомии. Наличие вирусной персистенции определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) в сыворотке крови методом определения вируснейтрализующих антител к вирусам гепатита В, С (HBV, HCV) и цитомегаловирусу (CMV). В качестве подтверждающего теста использовали ДНК-диагностику. Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали фрагменты длиной 1000 нуклеотидов из 10 изолятов, содержащие 5' - некодирующую область и ген, ответственный за синтез протеина p22. Органоспецифические антитела (ОСА) к тканям легких и печени, а так же антитела к ДНК исследовали в сыворотке крови и использовали тест-системы для твердофазного ИФА. Субпопуляции Т-лимфоцитов оценивали количественно с помощью моноклональных антител иммунофлюорисцентным методом, с использованием FITC - окраски. Материалом для исследования HLA-DR фенотипов служили лимфоциты периферической крови. Оценку экспрессии изоантигенов HLA-DR проводили методом комплементзависимой цитотоксичности с помощью типирующих сывороток: DR1, DR2, DR3, DR5, DR7, DR52. В качестве экспресс метода оценки использовали разработанную нами клеточную тест-систему на основе микроводорослей Dunaliella viridis. Оценивали изменение морфологии клеток и образование клеточных микро- и макроагрегатов.
Исследование частоты вирусной персистенции показали, что у подавляющего числа обследованных больных (89% случаев) выявлено достоверное увеличение содержания антител к CMV, у 10% больных выявлены антитела к HBV, у 9 % выявлен высокий титр антител к HCV. В некоторых случаях были выявлены антитела к двум и более вирусам. Метод ПЦР позволил выявить наличие вирусных нуклеотидных последовательностей у 76% обследованных больных. Высокая частота встречаемости вирусной персистенции может служить основанием для рассмотрения вирусной инфекции как триггерного фактора данного заболевания. Выявили достоверное увеличение антител к ядерной ДНК, к тканям легких и печени в обеих обследованных группах. Антитела к ткани печени (0,041 ед. Е) и денатурированной ДНК были значительно повышены у больных миастенией, протекающей на фоне гиперплазии ВЖ. У обследованных больных миастенией с тимомами выявили достоверное увеличение антител к денатурированной ДНК (0,083 ед. Е) и к ткани легких (0,075 ед. Е). Наличие специфических антител и их значительно отличающиеся титры могут быть использованы для дифференциальной диагностики иммунопатологических реакций и клинических фенотипов заболевания. Исследование субпопуляционного состава Т- лимфоцитов свидетельствует о существовании двух различных типов иммунного ответа: гиперэргический тип - высокий уровень CD4 Т-лимфоцитов и гипоэргический - нормальное содержание CD4 Т-лимфоцитов и снижение CD8 Т-лимфоцитов. Выявлена взаимосвязь различных клинических фенотипов миастении с экспрессией HLA-DR антигенов II класса. При миастении протекающей без поражения ВЖ выявлена наибольшая частота встречаемости DR5 гаплотипа. При гиперплазии ВЖ на фоне миастении с большой частотой встречаются фенотипы DR1 и DR5. При тимомах высокая частота встречаемости антигенов DR2 и DR7. Обосновано применение разработанной скринирующей клеточной системы тестирования иммунопатологических вариантов при различных клинических фенотипах миастении. Показано, что при миастении с гиперплазией ВЖ Dunaliella viridis образует небольшое количество микроагрегатов одноклеточной водоросли, а при тимомах образуются клеточные макроагрегаты - пальмелы, что может использоваться в качестве экспресс оценки больных миастеией.
На основании выявленных иммунопатологических вариантов при миастении и поражении ВЖ, при выборе комплексного лечения, целесообразно учитывать следующие ведущие и значимые факторы: наличие вирусной персистенции, полиморфизм гаплотипов HLA-DR, наличие активированных Т-хелперов CD4 или их негативную супрессию, наличие антител к денатурированной ДНК и к тканям легких. В зависимости от сочетания выявленных параметров необходимо применение направленной противовирусной терапии, назначение иммунодепресантов, проведение плазмофереза или же обязательное выполнение тимэктомии с последующей трансфузией криоконсервированных эмбриональных гемопоэтических клеток ранних сроков гистации и имплантация эмбриональных нервных клеток.