Морфологические аспекты проблемы заживления ран продолжают оставаться в центре
внимания исследователей на протяжении многих лет, несмотря на обилие
литературных данных по этой проблеме. Не случайно, что на
морфологических особенностях раневого процесса, включающих результаты
гистологического, гистохимического и электронно-микроскопичес-кого
исследования, базируется установление прижизненности и давности
причинения повреждений при производстве судебно-медицинских
экспертиз.
По сложившейся традиции, определение сроков возникновения повреждений основано на
выяснении степени выраженности и соотношения в пораженных тканях
процессов альтерации, воспаления и регенерации, сопровождающих
прижизненную реакцию организма на любое травматическое воздействие.
Однако в судебно-медицинской практике оценка проявления этих
процессов на гистологических препаратах, окрашенных
гематоксилин-эозином, не всегда удовлетворяет экспертов. Получаемая
информация, как правило, не отражает уровень дифференцировки
клеточных элементов и степень зрелости тканевых структур, что
приводит к существенной ошибке при интерпретации результатов
гистологического исследования.
Определенные перспективы в объективизации реактивных изменений и регенераторных
процессов, развивающихся в зоне повреждений, открываются в связи с
использованием в судебно-гистологической практике
иммуногистохимических методов, основанных на высокоспецифичном
взаимодействии антигена с антителом и позволяющих при наличии
соответствующих меченых антител выявлять практически любой тканевой
или клеточный антиген. Преимущество этих методов исследования стало
очевидным после разработки техники получения моноклональных антител и
выявления маркеров промежуточных филаментов, рецепторов факторов
роста, молекул адгезии и других. Достигнутые успехи в области
иммуноморфологии уже нашли свое отражение в судебно-медицинских
исследованиях (Int.J.Legal Med., 1992-1999), касающихся методических
подходов к оценке заживления кожных ран и разработки критериев
давности причинения повреждений.
Для этих целей в иммуногистохимических исследованиях используются маркеры различных
клеточных элементов, антитела к молекулам адгезии, компонентам
внеклеточного матрикса, про- и противоапоптозным белкам, а также к
антигенам пролиферирующих клеток. В ряде работ P.Betz e.a.
(1992-1995) на основании изучения локализации цитокератинов 5 и 13
прослежена динамика реэпителизации кожных ран и распределения в них
маркера пролиферации антигена Ki 67, что позволило обнаружить
пролиферирующие фибробласты начиная с 1,5 суток после повреждения.
Использование комплекса моно- и поликлональных антител дало авторам
возможность получить ценную информацию о прижизненности и сроках
образования ран кожи на основе изучения вновь синтезируемого
коллагена различных типов, тенасцина, ламинина, гепарансульфат
протеогликана, альфа-I-антихимотрипсина. Ими также было установлено
повышение содержания фибронектина во внеклеточном матриксе
соединительной ткани уже через несколько минут после травмы, даже до
появления в зоне повреждения гранулоцитов. Диагностическая значимость
изменений содержания и локализации фибронектина в ранах была
подтверждена исследованиями P.Klir е.а. (1996).
Проведенное J.Dressler е.а. (1997, 1999) иммуногистохимическое изучение кожных
ран способствовало обнаружению стойкой экспрессии ICAM-I (CD 54) в
кератиноцитах и эндотелиоцитах на сроках повреждения кожи от 1,5
часов до 3,5 суток, что коррелировало со степенью воспаления в ранах.
Этими авторами прослежены особенности состояния молекул адгезии на
эндотелии сосудов пораженной кожи по интенсивности позитивной реакции
на VCAM-I (CD 106) и PECAM-I (CD 31), наиболее выраженной на
сроках от 3 часов до 3,5 суток. Ими же была установлена строго
положительная иммуногистохимическая реакция на Р-селектин в интервале
от 3 минут до 7 часов после повреждения кожи. Это дало основание
рассматривать полученные результаты в качестве индикаторов
прижизненности и давности причинения ран кожи. Подобную значимость
может иметь степень экспрессии белка р53 фибробластсами поврежденной
ткани, отчетливо прослеживаемая спустя 3 суток с максимальной
выраженностью между 3-11 неделями (R.Hausmann е.а., 1998), а также
положительная иммуногистохимическая реакция на интерлейкин-1 альфа в
активированных нейтрофилах при сроках повреждения кожи от 4 часов до
1 суток (Т.Kondo е.а., 1999).
Ключевым звеном в процессе заживления ран является регенерация поврежденных тканей,
во многом связанная с интенсивностью пролиферации клеточных
элементов. Необходимым компонентом репаративной регенерации кожи
служат фибропластические процессы, приводящие к образованию рубцов,
структурные особенности которых могут отражать давность (срок)
причинения повреждений. Это в значительной мере определяет
целесообразность изучения в пораженных участках кожи экспрессии
ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA). Предварительные
результаты наших исследований, проведенных на крысах с нанесением в
области спины стандартных резаных ран кожи или термических
повреждений IIIб степени, свидетельствовали о возрастании на 2-3
сутки количества пролиферирующипх клеток в базальном слое эпидермиса
и на незначительном удалении от границ повреждения в сосочковом и
сетчатом слоях дермы. В зависимости от характера повреждения кожи
достоверное увеличение экспрессии PCNA в разных участках механических
и термических повреждений, как правило, ограничивалось интервалом 1-2
недели. Сопоставление полученных данных с результатами
гистологического и морфометрического исследования позволило
установить временные соотношения между пролиферативной активностью
клеточных элементов и мобилизацией клеток по краям повреждения,
миграцией эпителиоцитов на раневой поверхности, выраженностью
фибропластических процессов, интенсивностью формирования волокнистых
структур в различных зонах пораженной кожи.
Интенсивность процесса гибели клеток может служить надежным критерием оценки
особенностей репаративной регенерации кожи и, следовательно, давности
причинения повреждений. С этой точки зрения представляется
оправданным использование маркеров гибели клеток для установления
объема популяции кератиноцитов и клеток соединительной ткани,
вступающих в апоптоз в результате повреждения (Bcl-2, Bax, CD 95,
p53).
Анализ данных литературы и предварительные результаты наших исследований показывают, что
характер основных событий, развивающихся в коже после причинения
повреждений, можно установить при использовании, наряду с уже
отмеченными, следующих маркеров.
М а р к е р ы |
К л е т о ч н ы е т и п ы |
Цитокератины К5 и К14 |
Кератиноциты |
Десмин, альфа-гладкомышечный актин |
Миофибробласты |
CD 15 |
Гранулоциты |
Интерлейкин-1 альфа |
Активированные нейтрофилы |
LCA |
Лимфоциты |
CD 68, альфа-1-антихимотрипсин |
Моноциты |
ED 1 |
Макрофаги |
CD 41 |
Тромбоциты |
CD 56 |
NK-cell (естественные киллеры) |
|
Наши наблюдения за динамикой заживления термических ожогов и резаных ран у крыс свидетельствуют о
целесообразности одновременного применения в иммуногистохимических
исследованиях набора маркеров различных клеточных элементов и
тканевых структур (панели моно- и поликлональных антител).
Объективизировать получаемую при этом информацию следует путем
использования различных приемов морфометрического анализа,
позволяющих на иммуногистохимических препаратах определять точную
локализацию, а также количественное соотношение клеточных элементов и
тканевых структур в зоне повреждения. Таким образом, внедрение в
экспертную практику методов иммуногистохимического анализа означает
переход на более высокий уровень изучения посттравматической
регенерации тканей, что должно способствовать разработке достоверных
критериев оценки прижизненности и давности (сроков) причинения
повреждения.
Альманах судебной медицины N 2 (2001), стр.