Medline.ru - Исследование дисперсий фосфолипидов. 1. Меченый NBD-PE и Rh-PE пальмитоилолеоилфосфатидилхолин

РЕЗЮМЕ

В.П. Топалы, Э.Е. Топалы

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИСПЕРСИЙ ФОСФОЛИПИДОВ. 1. МЕЧЕНЫЙ NBD-PE И PH-PE ПАЛЬМИТОИЛОЛЕОЛФОСФАТИДИЛХОЛИН.

Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН

Исследованы полученные методом упаривания обращённой фазы экструдированные водные дисперсии меченого NBD-PE и Rh-PE в молярном отношении 1:1 пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (POPC). С ростом концентрации POPC флюоресценция дисперсии как при 530 нм (максимум эмиссии NBD-PE), так и при 577 нм (максимум эмиссии Rh-PE) при облучении фотонами 470 нм (максимум поглощения NBD-PE), монотонно возрастает. Это указывает на то, что перенос энергии от донора к акцептору осуществляется не по Фёрстеру и метод резонансного переноса энергии (РПЭ) неприменим для исследования дисперсий амфифилов. Флюоресценция дисперсий флуктуирует и уменьшается во времени. При длительном хранении (до 4 месяцев) маточной дисперсии в темноте при 25 °С флюоресценция также достоверно уменьшается. Эти факты не удаётся понять в рамках представления, будто исследованные дисперсии состоят из одноламеллярных липосом. В присутствии высоких концентраций детергента (выше ККМ - критической концентрации мицеллообразования) флюоресценция (F(Д)) резко возрастает с содержанием POPC в дисперсии. Значения F(Д) дисперсий с одинаковыми концентрациями красителей, но разными концентрациями POPC не удаётся сколько-нибудь сблизить даже при длительном (до 7 суток) непрерывном перемешивании при температуре 25 °С или при продолжительном (до 1 часа) облучении ультразвуком. Эта картина наблюдается с любым из использованных прежде для определения максимальной флюоресценции дисперсии (Fmax) детергентом (додецилсульфатом натрия, цетилтриметиламмоний бромидом, Тритоном Х-100, восстановленным Тритоном Х-100), а также с дигептилфосфатидилхолином. Эти факты демонстрируют, что необходимый для анализа результатов исследования липидных дисперсий методом резонансного переноса энергии (РПЭ) параметр Fmax невозможно определить с помощью детергентов. Кроме того, они показывают, что современные модели дисперсий детергентов неверны. Ошибочно представление, будто существует некоторая номинальная концентрация (ККМ), ниже которой детергент диспергирован до молекул, а выше до мицелл. Неверно также и представление будто при внесении в липидную дисперсию детергента до концентраций выше ККМ образуются смешанные детергентно-липидные мицеллы. Метод РПЭ для исследования слияния липосом и детергенты (цетилтриметиламмоний бромид и Тритон Х-100) для измерения Fmax рекомендуются Методами энзимологии (Hoekstra D., Duzgunes N.. Lipid mixing assays to determine fusion in liposome systems. Methods in Enzymology, v. 220, part A, p. 15-32, 1993), что является загадкой. Все приведённые в статье факты объясняются в рамках предлагаемой нами обобщённой модели дисперсий амфифилов. Модель и интерпретация описанных в статье фактов излагаются в следующих двух статьях этой серии.

Ключевые слова: липидная дисперсия; флюоресцентные метки; резонансный перенос энергии; детергенты; мицеллообразование; смешанные детергентно-липидные мицеллы.

ABSTRACT

Extruded aqoueos dispersions of fluorescently labeled with NBD-PE and Rh-PE in molar relation 1:1 palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC) prepared by inverse phase evaporation method were studied. Both 530 nm (maximum of NBD-PE emission) and 577 nm (maximum of Rh-PE emission) fluorescences of the dispersion irradiated with 470 nm fotons (maximum of NBD-PE excitation) monotonically increase with POPC concentration. This fact indicates that energy transfer from donor to acceptor is not accounted for by Forster's theory and the resonance energy transfer (RET) method is not suitable for studying dispersions of amphiphyles. The fluorescence of dispersions fluctuates and decreases in time. The recurring measurements of mother dispertions maintained in the dark at 25 °С over a long period of time (up to 4 months) also revealed the reliable decrease of fluorescence. These facts cannot be explained in the framework of hypothesis that the dispersions studied consist of unilamellar liposomes. In the presence of high concentrations (higher than CMC, critical micellar concentration) of an detergent the fluorescence (F(D)) sharply increases with POPC content of dispersion. F(D) values of dispersions with equal concentrations of dyes and detergent but different POPC concentrations cannot be in any measure drown together even if dispersions are stirred at 25 °С over a long period of time (up to 7 days) or ultrasonicated up to 60 min. This picture is observed with any of detergents (sodium dodecylsulfate, cetyltrimethylammonium bromide, Triton X-100, reduced Triton X-100) used earlier for determination of maximal dispertion fluorescence (Fmax) and with diheptylphosphatidylcholine also. These facts sdemonstrate that Fmax indispensable for analysis of the results obtained by RET method cannot be measured with the aid of detergents. Moreover they show that models of detergent dispersion are false. The assertion there is a nominal concentration (СМС) below which the detergent is dispersed to molecules and above which to micelles is incorrect. The statement the introduction into а lipid dispersion of detergent to а concentration above CMC results in formation of mixed detergent-lipid micelles is incorrect also. Methods in Enzymology recommend the RET method for studying the fusion of liposomes and detergents (cetyltrimethylammonium bromide and Triton X-100) for measuring Fmax (Hoekstra D., Duzgunes N., Lipid mixing assays to determine fusion in liposome systems. Methods in Enzymology, v. 220, part A, p. 15-32, 1993), and this is an enigma. All data of this paper are accounted for in the framework of generalized model of amphiphile dispersion proposed. The model and the interpretation of data are presented in the following two papers of this series.