Резюме
Иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга человека традиционно осуществляется методом проточной цитометрии и позволяет оценивать экспрессию нескольких маркеров одновременно. Использование многоцветного окрашивания требует корректной оценки получаемого изображения. Рассмотрены варианты коэкспрессии маркеров при проведении трехцветного окрашивания. Показана возможность оценки гетерогенности экспрессии маркеров на клетках одной популяции при анализе изображения в пространстве двумерной гистограммы.

Ключевые слова: иммунофенотипирование, проточная цитометрия, анализ изображения

Определение фенотипа клеток - как циркулирующих в крови, так и входящих в состав сложных тканей, на сегодняшний день не составляет особого труда. Для этого используют способность клеток связываться со специфическими антителами. Так как антитела могут быть получены практически к любому белку (или его фрагменту) с установленной аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью соответствующей ДНК, то и иммунофенотипирование (ИФТ) может быть использовано практически в любых областях биологии и медицины¹ . В любом случае для визуализации целевых молекул используют антитела, меченные ферментами, металлами или флюорохромами. Проточная цитометрия (ПЦ), использующая в качестве метки моноклональных антител такие стабильные флюорохромы как флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), фикоэритрин (ФЭ), перидинин-хлорофилл протеин (Per CP) и др., обладает практически неограниченными возможностями по оценке клетки и ее компонентов. Выявление флюоресценции каждого из этих флюорохромов и усиление светового сигнала на фотоумножителях проточного цитометра позволяет одновременно получать информацию о физических параметрах клетки (размер и гранулярность) и о наличии/отсутствии экспрессии тех или иных антигенов (маркеров)² . Развитие технологий достаточно быстро перевело проточные цитометры из разряда приборов научного использования в рутинное оборудование клиник и сделало саму ПЦ золотым стандартом лабораторной диагностики в области иммунофенотипирования клеток³ . Анализ коэкспрессии маркеров позволяет определять субпопуляционную принадлежность лимфоцитов и выявлять опухолевые клетки в присутствии нормальных клеточных компонентов крови и костного мозга.

Пробоподготовка
Стандартная пробоподготовка для выявления поверхностных маркеров клеток периферической крови и костного мозга осуществляется по протоколам окрашивание-лизис-отмывка и окрашивание-лизис-без-отмывки⁴ . При необходимости отсрочить анализ на 2-24 часа пробоподготовка может быть дополнена фиксацией клеток образца. При необходимости выявления внутриклеточных маркеров в протокол окрашивания должна быть включена процедура пермеабилизации⁵. При работе с клеточной суспензией, в которой по определению отсутствуют эритроциты (например, ликвор или суспензия мононуклеаров, полученная в результате градиентного центрифугирования) из протокола пробоподготовки может быть исключена процедура лизиса.

Учет результатов
Анализ антигенной экспрессии осуществляется на проточном цитометре с использованием программного обеспечения для анализа больших массивов данных. Возбуждение флюоресценции происходит при прохождении клеткой фокального пятна аргонового лазера, охлаждаемого воздухом (мощность 15 mW, испускаемая длина волны 488 нм). Учет флюоресценции осуществляется при 512-547 нм, 572-591 нм и более 610 нм для FITC, PE и PerCP/PE-Cy5 каналов флюоресценции на первом (FL1), втором (FL2) и третьем (FL3) фотоумножителях соответственно. Таким образом, получают данные по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию, а также по флюоресценции клеток, связавших флюорохром-конъюгированные антитела. Компенсация наложения флюоресценции осуществляется средствами программного обеспечения. Позитивность окрашивания с любым антителом оценивается при наложении квадрантов, определенных отрицательным изотипическим контролем.

Представление данных
Данные по прямому и боковому светорассеянию исследуемых клеток отражают на двумерных гистограммах FSC/SSC (прямое forward side scatter (FSC) и угловое side scatter (SSC) светорассеяние). Для сигнала по FSC и SSC обычно используют линейное усиление, сигналы флюоресценции могут быть усилены до четырех (пяти) декадной логарифмической шкалы. Логическое ограничение лимфоцитарного гейта определяется по нижнему и верхнему значению лимфоцитарного пика на одномерной гистограмме и применяется к двумерным гистограммам. Моноцитарный гейт касается лимфоцитарного гейта с превышением значения SSC в полтора раза. Гранулоцитарный гейт касается моноцитарного гейта и распространяется вверх по всей оси SSC. Левая и правая границы моноцитарного и гранулоцитарного кластеров определены по соответствующим пикам на одномерных гистограммах. При использовании одноцветного анализа с различными флюорохромами сигналы фотоумножителей FL1, FL2 и FL3 отражены на одномерных четырехдекадных гистограммах. При использовании многоцветного анализа данные по каналам флюоресценции отражены на двумерных четырех декадных log/log гистограммах (FL1/ FL2, FL2/ FL3 и FL3/ FL1). Квадранты в этих гистограммах (FL1/ FL2 (FITC/PE), FL2/ FL3 (PE/PerCP) и FL3/ FL1 (PerCP/FITC)) определяют две разделительные линии, фиксированные для всех измерений на одной четверти шкалы флюоресценции по абсциссе и ординате. Для анализа малоклеточных популяций могут быть также использованы смешанные линейно-логарифимированные гистограммы SSC/FL(1-3).

Анализ данных
Анализ данных заключается в определении положения кластера клеток в многомерном пространстве проточной цитометрии. При выявлении на двумерной гистограмме Fl2/Fl1 кластера событий, позитивного по обоим маркерам, использование трехцветной метки позволяет получить четыре варианта экспрессии третьего маркера (рис.1.)


Варианты экспрессии третьего маркера на популяции клеток, позитивной по двум маркерам. На гистограмме экспрессии антигенов 1 и 2 (Аг1 и Аг2) выявлен кластер событий, позитивный по обоим антигенам (А). Внутри этого кластера экспрессия антигена 3 (Аг3) может отсутствовать (кластеры Б и В), либо быть выражена (присутствовать) (кластеры Г и Д). Таким образом, получена возможность выявить внутри кластера А четыре варианта сочетаний экспрессии маркеров: Аг1⁺Аг3^- (Б), Аг2⁺Аг3^- (В), Аг1⁺Аг3⁺ (Г) и Аг2⁺Аг3⁺ (Д).

При одновременном использовании трех антител возможно получение восьми комбинаций положительных и отрицательных популяций (табл1),

Фотоумножитель	Регистрация сигнала флюорохрома			Обозначение кластера на гистограмме
	Fl1	Fl2	Fl3
Fl1	-	-	-	А
	+	-	-	Б
Fl2	-	+	-	В
	+	+	-	Г
Fl3	-	-	+	Д
	+	-	+	Е
	-	+	+	Ж
	+	+	+	З

расположение которых в пространстве трех четырехдекадных гистограмм (FL1/Fl2, Fl2/Fl3, Fl3/Fl1) строго определено (рис.2).


Варианты сочетанной экспрессии (бинарный вариант). Варианты сочетанной экспрессии маркеров при трехцветном окрашивании. При совместном использовании трех антител возможно получение восьми комбинаций положительных и отрицательных популяций в пространстве трех двумерных гистограмм. Буквенные обозначения аналогичны табл. 1.

Такое изображение может быть получено при гомогенном характере экспрессии, т.е. в том случае, если все клетки популяции однородно экспрессируют каждый анализируемый маркер.

Анализ коэкспрессии маркеров
Далеко не во всех случаях, популяция, позитивная по экспрессии одного маркера, также однородно экспрессирует другой маркер. Для оценки гетерогенности экспрессии маркеров на клетках одной популяции может быть использована схема изображения возможных вариантов коэкспрессии в пространстве двумерной гистограммы (рис.3).



Типы коэкспрессии антигенов. На гистограмме А представлена однородная экспрессия Аг2 и неоднородная коэкспрессия Аг1 клетками анализируемой популяции. На гистограмме Б представлен обратный вариант однородной экспрессии Аг1, при котором неоднородным образом коэкспрессируется Аг2. На гистограмме В вяывлено две популяции: популяция Аг1+Аг2- и Аг2+ популяция, обладающая гетерогенной экспрессией Аг1+. На следующих двух гистограммах изображены популяции, позитивные по одному исследуемому маркеру и негативные по другому: на гистограмме Г - популяции Аг1-Аг2+ и Аг1+Аг2+, на гистограмме Д - популяции Аг1+Аг2- и Аг1+Аг2+. При получении результата, изображенного на гистограмме Е, корректная интерпретация данных затруднена в связи с высоким уровнем аутофлюоресценции Аг1-Аг2- и наличием мертвых клеток, которые неспецифически, в равных количествах, связывают маркеры обоих антигенов. Количественное совпадение относительного содержания популяций с одинаковым суммарным фенотипом, выявленных на различных гистограммах, является внутренним контролем качества пробоподготовки.

Фактически на двумерной гистограмме может быть представлено всего несколько вариантов коэкспрессии маркеров.

Заключение
Мультипараметрический анализ данных ПЦ основан на анализе изображения, отражающего гомогенный или гетерогенный характер экспрессии маркера (маркеров) изучаемой популяции. Процесс обработки данных может быть автоматизирован и стандартизован, однако далеко не все биологические образцы удовлетворяют условиям автоматической обработки изображения⁶ . Следовательно, сохраняется роль эксперта, сопоставляющего данные ИФТ с морфологией и клинической картиной заболевания. Отрицательные результаты ПЦ также должны соответствовать результатам других исследований. Таким образом, максимальная точность в диагностике достигается при сочетанном использовании автоматизированного анализа изображения и экспертной оценки биологического образца и позволяет точно ответить на простой вопрос пациента: "Я болею лейкозом?"

---

^* Адрес для переписки: Зуева Екатерина Евгеньевна, с.н.с. лаборатории молекулярной диагностики Научно-методического центра по молекулярной медицине СПбГМУ им. акад.И.П.Павлова, ул. Л.Толстого, 6/8, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197089. Тел/факс: +7 812-2387194, e-mail: dinzu@mail.ru

¹ Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под ред. С.Херрингтона и Дж. Магки, М.,Мир, 1999, 506 стр.

² Horsburg T., S. Martin, A.J.Robson The application of flow cytometry to histocompatibility testing. Transplant Immunology 2000, 8 (1):3-15.

³ Gelman R., Wilkening C. Analyses of quality assessment studies using CD45 for gating lymphocytes for CD3+CD4+%. Cytometry (Comm in Clin Cytometry) 2000; 42:1-4.

⁴ Gratama JW, Sutherland DR, Keeney M, Papa S. Flow cytometric enumeration and immunophenotyping of hematopoietic stem and progenitor cells. J Biol Regul Homeost Agents 2001;15:14-22.

⁵ Hrusak O., Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns reflecting enotype of acute leukemias. Leukemia 2002; 16:1233-1258.

⁶ Cualing HD. Automated analysis in flow cytometry. Cytometry. 2000 Apr 15;42(2):110-3

Свидетельство о регистрации сетевого электронного научного издания Медлайн.Ру - N 227 от 20 октября 2008 года.
Выдано ФГУП "Информрегистр"

Свидетельство о регистрации журнала Медлайн.Ру Эл N ФС № 77-33585 от 24 сентября 2008 года

Журнал основан 16 ноября 2000г.
Выдано Министерством РФ по делам печати, телерадиовещания и средств массовых коммуникаций

(c) Перепечатка материалов сайта Medline.Ru возможна только с письменного разрешения редакции