Опубликовать статью

Информационное партнерство

Инфоресурсы

Контакты

ТОМ 2, СТ. 49 (сc. 223-297) // 28-31 мая 2001 г.,

Юбилейная X Конференция "Нейроиммунология"

---

Cистема детекции продукта в полимеразной цепной реакции (ПЦР) "real-time" (ПЦР реального времени, мониторинговая ПЦР) позволяет цикл за циклом следить за накоплением амплифицированной ДНК. Мониторинговая ПЦР является гомогенной, т.е. при применении данного метода не происходит разделения компонентов реакции, как это бывает при использовании электрофорезе в геле.
Одним из подходов мониторинговой ПЦР является использование системы TaqMan, основанной на трансфере энергии флюоресценции.
Система включает в себя олигонуклеотидную пробу, которая способна присоединяться (гибридизироваться) к внутреннему сегменту ДНК-мишени. На 5'- конце проба помечена флюоресцентным красителем-репортером (reporter dye), а на 3'- конце - блокатором (quencher dye). Cпектр и эмиссия последнего перекрывают спектр и эмиссию репортера, приводя к блокированию флюоресцентного сигнала. По мере накопления продукта ПЦР, проба гибридизируется к нему, однако свечения не происходит из-за близости между репортером и блокатором.. По мере копирования последовательности, к которой присоединена проба, ДНК полимеразой, полимераза достигает 5'-конца пробы. 5'-3' экзонуклеазная активность полимеразы отсоединяет флюоресцентную метку с 5'- конца пробы, тем самым освобождая флюоресцирующий репортер от его связи с блокатором сигнала, что и приводит к увеличению флюоресценции. Уровень флюоресценции, таким образом, пропорционален количеству специфичного продукта реакции.
Для количественного выражения экспрессии того или иного гена необходимо наличие эндогенного контроля. Обычно для этого используют гены, характеризующиеся наиболее постоянной экспрессией (так называемые house-keeping genes), такие как бета-актин, глицеральдегид -3 фосфат дегидрогеназа (ГАФДГ), рибосомальную РНК и т.д.
Преимущество мультикомпонентной ПЦР состоит в том, что при ней наличие разнообразных флюоресцентных красителей позволяет амплифицировать и производить детекцию как интересующего нас гена (например, какого-либо цитокина), так и гена эндогенного контроя (бета-актина) одновременно, т.е. в одной и той же пробирке.
Для относительного количественного выражения результатов используется кривая стандартов. Производятся разведения стандартов (ДНК здоровых доноров, полученная после различной стимуляции цельной крови, например при помощи ФГА, ЛПС, в течение различного времени), обычно в логарифмической последовательности - 1:3, 1:9 и т.д. Для количественного выражения экспрессии интересующего нас гена в пробах, которые были нормализованы по эндогенному контролю, стандартные кривые строятся как для искомого гена, так и для эндогенного контроля, т.е. бета-актина.
На начальных циклах ПЦР флюоресценция очень мало выражена и мало изменяется. Этот уровень свечения называется базовым. Показателем накопления продукта реакции является так называемый "пороговый цикл" (Ct, threshold cycle), т.е. цикл, на котором интенсивность флюоресценции начинает превышать базовый порог. Чем меньше номер цикла, с которого начинается амплификация продукта, тем, соответственно, выше экспрессия искомого гена.

Таким образом, за счет использования значений пороговых циклов, мониторинговая ПЦР делает более точной количественную оценку экспрессии генов и позволяет достичь более достоверных результатов.